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樣品中微生物定量檢驗方法的驗證

① 準確度

微生物定量檢驗的準確度是指替代方法的檢驗結果與藥典方法檢驗結果一致的程度,通常用微生物的回收率(%)來表示。


準確度驗證的方法:制備試驗菌的菌懸液,菌懸液的濃度應選擇為能夠準確計數的最高濃度,然后系列稀釋至較低濃度(如小于10cfu/ml)。例如,菌落計數平皿法的替代方法,在制備髙濃度菌懸液時其濃度是103 cfu /ml,系列稀釋至100cfu/ml。每個試驗菌應至少選擇5個菌濃度進行準確度確認,替代方法的檢驗結果不得少于藥典方法檢驗結果70% ,也可以采用合適的統計學方法表明替代方法的回收率至少與藥典方法一致。當替代方法的回收率高于藥典方法時,有必要結合專屬無菌檢查方法適用性。


② 精密度

精密度驗證的方法是:制備試驗菌的菌懸液,齒懸液的濃度應選擇為能夠準確讀數的最高濃度,然后系列稀釋至較低濃度(如小于10cfu/ml)。每個試驗菌選擇其中至少5個濃度的菌懸液進行檢驗。每一個濃度至少應進行10次重復檢驗,以便能夠采用統計分析方法得到標準偏差或相對標準偏差


③ 專屬性

專屬性驗證應證明當樣品中存在一定數量的試驗菌時,通過平皿法檢驗,能夠檢出試驗菌,而樣品的存在不會對結果造成影響。專屬性驗證時,應能夠設計出可能使替代方法出現假陽性的實驗模型來挑戰替代方法。當替代方法不依賴微生物生長出菌落或出現混濁就可以定量時(如不需要增菌或在1?50cfu范圍內就可直接測定菌數的定量方法),以上驗證方式就顯得更為重要。


④ 定量限

定量限驗證的方法是:在檢驗范圍的低限制備5 份不同含菌濃度的菌懸液,每份菌懸液分別用藥典方法和替代方法進行不少于5 次檢驗,采用統計方法比較替代方法的檢驗結果與藥典方法結果的差異,從而評價替代方法的定量限


⑤ 線性和范圍

線性驗證時必須覆蓋能夠準確測定的所有濃度范圍。每株試驗菌應選擇至少5個濃度,每個濃度至少測定5次。根據以上實驗數據,以檢驗結果為因變量,以樣品中微生物的預期數量為自變量進行線性回歸分析,計算相關系數r。替代方法的相關系數不得低于0.95。


微生物定量檢驗的范圍是指能夠達到一定的準確度、精密度和線性,檢驗方法適用的髙低限濃度或數量的區間。


⑥ 重現性

在樣品中接種一定數量的試驗菌(接種量應在定量限以上),采用藥典方法和替代方法,分別由不同人員,在不同時間,使用不同的試劑(或儀器)進行檢驗,對檢驗結果進行統計分析,以相對標準偏差(RSD) 來評價兩種方法的重現性差異。


⑦ 耐用性

替代方法與藥典方法的耐用性比較不是必須的,但應單獨對替代方法的耐用性進行評價,以便了解方法的關鍵操作點。

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